Defining the core proteome of the chloroplast envelope membranes

High-throughput protein localization studies require multiple strategies. Mass spectrometric analysis of defined cellular fractions is one of the complementary approaches to a diverse array of cell biological methods. In recent years, the protein content of different cellular (sub-)compartments was approached. Despite of all the efforts made, the analysis of membrane fractions remains difficult, in that the dissection of the proteomes of the envelope membranes of chloroplasts or mitochondria is often not reliable because sample purity is not always warranted. Moreover, proteomic studies are often restricted to single (model) species, and therefore limited in respect to differential individual evolution. In this study we analyzed the chloroplast envelope proteomes of different plant species, namely, the individual proteomes of inner and outer envelope (OE) membrane of Pisum sativum and the mixed envelope proteomes of Arabidopsis thaliana and Medicago sativa. The analysis of all three species yielded 341 identified proteins in total, 247 of them being unique. 39 proteins were genuine envelope proteins found in at least two species. Based on this and previous envelope studies we defined the core envelope proteome of chloroplasts. Comparing the general overlap of the available six independent studies (including ours) revealed only a number of 27 envelope proteins. Depending on the stringency of applied selection criteria we found 231 envelope proteins, while less stringent criteria increases this number to 649 putative envelope proteins. Based on the latter we provide a map of the outer and inner envelope core proteome, which includes many yet uncharacterized proteins predicted to be involved in transport, signaling, and response. Furthermore, a foundation for the functional characterization of yet unidentified functions of the inner and OE for further analyses is provided

Ein ERAD-abgeleiteter Präproteintranslokator in der periplastidären Membran der Chromalveolaten?

Die sekundären Plastiden der Chromalveolaten sind von drei oder vier Hüll¬membranen umgeben. Sie lassen damit ihren (sekundär) symbiogenetischen Ursprung aus einer ehemals frei lebenden phototrophen Eucyte (einer ancestra¬len Rhodophyte) erkennen. In Cryptophyten, den Vertretern mit den ursprüng¬lichsten Plastiden dieser Gruppe, zeugt der remanente Nucleus im periplasti¬dären Kompartiment (PPC) des Symbionten, das Nucleomorph, zusätzlich von dieser Herkunft. Ein wesentlicher Bestandteil in der Etablierung der sekundären Symbiose war der Transfer von genetischem Material von den Genomen des Symbionten in das Genom des Wirtes und dessen subsequente Eliminierung am Ursprungs¬lokus. Dies jedoch setzte die Entwicklung geeigneter Mechanismen zum Reim¬port der nun nucleuscodierten Proteine voraus. Konkrete Hinweise auf die Natur dieser Mechanismen gibt es nur von der äußersten bzw. innersten der vier Hüllmembranen der Plastide. Für die weiteren Transportvorgänge der Pro¬teine, vor allem über die zweite, periplastidäre Membran (PPM), werden bislang nur alternative Modelle kontrovers diskutiert. Ausgehend von der Analyse des nucleomophcodierten Proteins Gt_ORF201 der Cryptophyte Guillardia theta, wurden eine Reihe von Faktoren identifiziert, die Homologien zu Komponenten des ER-assoziierten Degradations Systems (ERAD) aus Saccharomyces cerevisiae aufweisen, deren Kern eine Maschinerie zur Dislokation missgefalteter sekretorischer Proteine aus dem ER bildet. Dies waren u.a. Homologe zu den Membranproteinen Der1p und Hrd1p, zur ATPase Cdc48p und ein Homolog zum Cdc48-Cofaktor Ufd1p. Exemplarisch wurde ge¬zeigt, dass Gt_ORF201 funktionell ortholog zu seinem Homolog Der1p aus Hefe ist und sich in Guillardia theta in der periplastidären Membran des Symbionten befindet. Durch eingehende Datenbank Analysen bereits vollständig sequenzierter Chromalveolatengenome (u.a. von Phaeodactylum tricornutum, Plasmodium fal¬ciparum) wurde eine Konservation der identifizierten symbiontspezifischen Fak¬toren (hier im Nucleus als Präprotein mit PPC/PPM-relevanter Zielsteuerungs¬sequenz codiert) innerhalb der Gruppe der Chromalveolaten gezeigt. Da das symbiontische "ERAD-System" in allen untersuchten Organismen parallel zur ERAD-Maschinerie des Wirtes existiert, und die homologen Fak¬toren in Saccharomyces cerevisiae vornehmlich an den prädegradativen Prozes¬sen der Substratdislokation aus dem ER beteiligt sind, wurde für die symbion¬tischen Faktoren eine neue, ERAD-unabhängige Funktion beim Transport nuc¬leuscodierter (peri-) plastidärer Präproteine über die PPM postuliert. Basierend auf den Prinzipien der Substratdislokation in ERAD wurde in dieser Arbeit erstmalig ein experimentell nachprüfbares Modell für den Präpro¬teinimport an der periplastidären Membran erarbeitet

Der1-mediated Preprotein Import into the Periplastid Compartment of Chromalveolates?

Phototrophic chromalveolates possess plastids surrounded by either 3 or 4 membranes, revealing their secondary endosymbiotic origin from an engulfed eukaryotic alga. In cryptophytes, a member of the chromalveolates, the organelle is embedded within a designated region of the host's rough endoplasmic reticulum (RER). Its eukaryotic compartments other than the plastid were reduced to the mere remains of its former cytosol, the periplastid compartment (PPC, PP space), and its nucleus, the nucleomorph, separated from the RER by its former plasma membrane, the periplast membrane (PPM). In the nucleomorph genome of the cryptophyte Guillardia theta, we identified several genes sharing homology with components of the ER-associated degradation (ERAD) machinery of yeast and higher eukaryotes, namely ORF201 and ORF477, homologs of membrane-bound proteins, Der1p (Degradation in the ER protein 1) and the RING-finger ubiquitin ligase Hrd1, and a truncated version of Udf1, a cofactor of Cdc48, a lumenal ATPase. Exemplarily, studies on the Der1-homolog ORF201 showed that this protein partially rescued a yeast deletion mutant, indicating the existence of a functional PPC-specific ERAD-like system in cryptophytes. With the noninvestigated exception of haptophytes a phylogenetically and mechanistically related system is apparently present in all chromalveolates with 4 membrane bound plastids because amongst others, PPC-specific Derlins (Der1-like proteins), CDC48 and its cofactor Ufd1 were identified in the nuclear genomes of diatoms and apicomplexa. These proteins are equipped with the required topogenic signals to direct them into the periplastid compartment of their secondary symbionts. Based on our findings, we suggest that all chromalveolates with 4 membrane bound plastids express an ERAD-derived machinery in the PPM of their secondary plastid, coexisting physically and systematically adjacent to the host's own ERAD system.We propose herewith that this system was functionally adapted to mediate transport of nucleus-encoded PPC/plastid preproteins from the RER into the periplastid space